2020年10月8日，爱思唯尔（Elsevier）旗下著名分析化学期刊Analytica Chimica Acta（IF：5.977）在线发表了十大赌博老品牌网站 陶生策团队的最新研究成果“Multiplex and Visual Detection of African Swine Fever Virus (ASFV) based on Hive-Chip and Direct Loop-mediated Isothermal Amplification”。该研究基于“蜂巢芯片（Hive-Chip）”和“LAMP直扩法”提出了针对非洲猪瘟病毒多基因并行检测的全流程方案，具有无需核酸提取、不依赖精密仪器及避免因病毒的单个基因突变引起的假阴性问题，且灵敏度高、特异性强、可视化检测以及适用于POCT（Point of Care Testing，即时检测/床旁检测）等优点。本研究也已申请相关专利“一种靶标基因组合在非洲猪瘟病毒检测中的应用及试剂盒”。
非洲猪瘟 (African swine fever, ASF) 是由非洲猪瘟病毒 (African swine fever virus, ASFV) 引起的猪的一种急性、高度传染性和致死性的疾病，死亡率高达100%。截止到2020年3月5日，中国已有32个省份共爆发165起非瘟疫情，累计扑杀生猪1,193,000头，给中国乃至全世界的养猪业带来巨大的威胁。ASFV是一种呈二十面体对称的dsDNA病毒，基因组巨大（170~190 kb），由于其复杂的基因组成和高度变异性，已根据同源性较高的编码衣壳蛋白VP72的基因B646L被划分为24个基因型。目前，ASF尚无有效的治疗方式和疫苗，扑杀和焚烧是防止疫情蔓延最有效的手段，因此快速、准确地检测ASFV至关重要。
现有ASFV核酸检测方法主要存在两个问题：只针对ASFV单基因进行检测，依赖于复杂精密的仪器。针对问题一，本研究首先根据ASFV序列比对结果获得了较保守的5个基因（B646L、B962L、C717R、D1133L、G1340L），并针对每个基因设计4套LAMP（Loop-mediated isothermal amplification，环介导等温扩增）引物，通过In-tube LAMP和On-Chip LAMP进行了有效性（Validity）、特异性（Specificity）和灵敏度（Sensitivity）测试，得到了一组能够用于ASFV多基因检测的LAMP引物，有效避免因单个基因突变而造成的假阴性结果，提高阳性检出率；针对问题二，本研究采用物理隔离的策略，将10根毛细管通过PDMS（聚二甲基硅氧烷）基座集成起来形成酷似蜂窝煤的“蜂巢芯片”，并进行疏水修饰。每根毛细管内固定不同基因所对应的LAMP引物，借助加样接头（Adaptor）和毛细现象，使样本同时分散到各个毛细管内，进行等温扩增和荧光检测，实现了一次反应同时检测多个基因，并且LAMP直扩法免去了核酸提取步骤。
基于此，我们分别对猪血模拟样本和ASFV基因组DNA样本成功进行了检测，并以其他猪病毒基因组DNA样本（包括猪伪狂犬病病毒PRV、猪圆环病毒2型PCV2以及猪细小病毒PPV）进行了特异性检测。为了进一步证明ASFV多基因检测的必要性，我们将现有ASFV菌株（GenBank: EF121429.1, MH025920.1, KM111295.1，MH025919.1）存在的点突变引入B646L基因质粒中，芯片检测结果发现该位点（即1号毛细管）呈阴性，而其他毛细管呈阳性，表明如果此时只检测B646L基因，就会出现假阴性结果。
综上，本研究针对ASFV开发了通用的多重核酸检测平台，特别是针对易变的病原体（例如新冠病毒），通过一次反应检测多个基因，既能实现多重可视化检测，又不依赖精密仪器和专业操作，适合口岸检验检疫和现场即时检测。
本研究的第一作者为上海交通大学2017级博士研究生朱元首，通讯作者为上海交通大学陶生策研究员和北京博奥生物张岩博士。
原文链接： //www.sciencedirect.com/science/article/pii/S000326702031015
稿件来源：陶生策课题组
图文编辑：王华瑶
